kaiyun网页登录入口 开云在线是一位经验丰富的生物化学家，对RNA有着丰富的知识。她们一起成功地在试管中再造了细菌的基因剪刀，并简化了剪刀的分子组成，使其更容易使用。两个人因为发现年诺贝尔化学奖。其实还有一些生物学家对基因编辑技术做出了很多贡献，例如华人科学家张锋首次证明

　　之后大家继续思考，既然crRNA可以引导Cas蛋白特异性识别靶序列，那CRISPR技术是否也可以应用于核酸检测中？答案是肯定的。随着对CRISPR/Cas系统研究的不断深入，Cas蛋白的特点及功能活性被逐渐认识并应用，并且发现了更多的Cas蛋白，Cas12a、Cas13a等被定义并命名。表1中列出用于分子诊断的CRISPR/Cas系统及其特点。其中可以看到，Cas12a主要靶向单链或双链DNA，而Cas13a可以直接靶向RNA。

　　2018年，Chen等研究发现当CRISPR/Cas12a蛋白以序列特异性的方式切割dsDNA时，会诱发强烈的、非特异性ssDNA的反式切割。作者利用Cas12a这一附属切割活性开发了一种准确快速的检测方法。该检测方法将Cas12a与等温扩增相结合，命名为DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter)，并实现患者样品中人瘤病毒(HPV)高灵敏检测。

　　从样本中提取HPV的DNA，通过重组聚合酶等温扩增对DNA进行扩增，再将Cas12a-crRNA复合物和标记有荧光淬灭的单链DNA探针加入反应体系。当Cas12a-crRNA复合物特异性结合并切割HPV的DNA时，激活Cas12a的非特异反式切割，即对单链DNA探针进行切割，ssDNA荧光基团在被切割后产生荧光信号并完成对样本中HPV DNA的特异性检测。DETECTR可以对样本中HPV16和HPV18进行准确检测，相关原理示意图见图2。对25个样本进行DETECTR检测结果与普通PCR检测进行对比，结果完全符合。

　　2018年Gootenberg等对SHERLOCK技术进行升级，可以实现在单个反应中检测3 个ssRNA 靶标和1 个dsDNA靶标。研究人员对17 种CRISPR/Cas13a和/Cas13b酶进行了生化鉴定，选择了3 种具有不同切割偏好的Cas13蛋白(LwaCas13a、PsmCas13b 和CcaCas13b)与Cas12a和RPA结合使用，每一种扩增的核酸靶标与对应的Cas-crRNA相结合，可激活对应Cas蛋白的活性而切割其对应的特异性底物，从而产生多种不同的荧光响应，实现对不同靶标的检测。相关原理见图3-b。

　　但是根据上面的应用可以看出，CRISPR/Cas技术通常需要与等温扩增等技术一起使用才能完成检测，需要RPA对目标靶标扩增后，CRISPR/Cas主要发挥的是特异性检测的作用，是否可以不经RPA等技术扩增而直接利用CRISPR技术进行核酸检测呢？很多学者也在这方面进行了各种探索。

　　Hajian等在2019年开发一种CRISPR芯片，该芯片材质基底为石墨烯，利用场效应晶体管与CRISPR/Cas系统结合来检测是否有目标序列的存在。石墨烯芯片上预制许多CRISPR/dCas9分子复合物。其中dRNP复合体可以解旋双螺旋DNA，并且扫描整条DNA链，如果发现目标序列，dRNP复合体就可以调控场效应晶体管来输出电信号完成检测。但是整个芯片的检测成本较高。相关示意图见图4.

　　2019年，Dai等通过探索Cas12a（cpf1）的反式剪切活性，想要开发一种通用的电化学传感器。如图5所示，Cas12a既有crRNA介导的特异性的顺式剪切（cis-cleavage），也有非特异性的反式剪切活性（trans-cleavage）。图5B中结合有亚甲基蓝燃料的非特异的单链DNA分子被固定在金电极上。如果存在目标分子，Cas12a-crRNA就会介导对非特异ssDNA分子的反式剪切，产生较低的电化学信号；而如果没有目标分子存在，Cas12a-crRNA不会激活其反式剪切活性，分子不会被切割，就会产生比较高的电化学信号，以此来判断是否存在目标序列。

　　3）陆续发现新的更有价值的Cas蛋白，可以更特异以及准确的进行分子检测。

　　1）设计时在3’端需要合适的PAM序列，PAM序列使crRNA引导Cas蛋白正确识别靶序列的必要条件；

　　3）目前大部分都是与RPA等扩增技术联合使用，但是扩增也可能会引入误差，同时也有污染的风险。

　　CRISPR/Cas技术在核酸检测中发挥了重要作用，为核酸检测提供了新的思路。未来的研发方向主要是更加流程化，减少中间的操作步骤，使得检测更加快速和便捷。随着基于CRISPR/Cas技术的核酸检测平台的不断发展，未来在分子诊断方面将发挥更重要的作用。